Nous avons partagé plusieurs considérations la semaine dernière concernant l'utilisation de l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose, et nous terminerons ce sujet ici aujourd'hui pour votre référence.
Sélection de Concentration du tampon
La concentration du tampon utilisée dans l’électrophorèse sur membrane d’acétate de cellulose est généralement inférieure à celle utilisée dans l’électrophorèse sur papier. Le pH 8,6 couramment utiliséBle tampon arbital est généralement choisi dans la plage de 0,05 mol/L à 0,09 mol/L. Lors de la sélection de la concentration, une détermination préliminaire est effectuée. Par exemple, si la longueur de la bande de membrane entre les électrodes dans la chambre d'électrophorèse est de 8 à 10 cm, une tension de 25 V est requise par centimètre de longueur de membrane et l'intensité du courant doit être de 0,4 à 0,5 mA par centimètre de largeur de membrane. Si ces valeurs ne sont pas atteintes ou dépassées pendant l'électrophorèse, la concentration du tampon doit être augmentée ou diluée.
Une concentration de tampon trop faible entraînera un mouvement rapide des bandes et une augmentation de la largeur de bande. En revanche, une concentration de tampon trop élevée ralentira la migration des bandes, rendant difficile la distinction de certaines bandes de séparation.
Il convient de noter que dans l’électrophorèse sur membrane d’acétate de cellulose, une partie importante du courant est conduite à travers l’échantillon, ce qui génère une quantité considérable de chaleur. Parfois, la concentration du tampon choisie peut être considérée comme appropriée. Cependant, dans des conditions de température ambiante élevée ou lors de l'utilisation d'une tension plus élevée, l'évaporation de l'eau due à la chaleur peut s'intensifier, entraînant une concentration de tampon trop élevée et même un dessèchement de la membrane.
Volume de l'échantillon
Dans l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose, la quantité de volume d'échantillon est déterminée par divers facteurs, notamment les conditions d'électrophorèse, les propriétés de l'échantillon lui-même, les méthodes de coloration et les techniques de détection. En règle générale, plus la méthode de détection est sensible, plus le volume de l'échantillon peut être réduit, ce qui est avantageux pour la séparation. Si le volume de l’échantillon est excessif, les schémas de séparation électrophorétique peuvent ne pas être clairs et la coloration peut également prendre du temps. Cependant, lors de l'analyse quantitative des bandes colorées séparées à l'aide de méthodes de détection colorimétrique par élution, le volume de l'échantillon ne doit pas être trop petit, car cela peut entraîner des valeurs d'absorbance plus faibles pour certains composants, conduisant à des erreurs plus importantes dans le calcul de leur contenu. Dans de tels cas, le volume de l’échantillon doit être augmenté de manière appropriée.
Généralement, le volume d'échantillon ajouté sur chaque centimètre de la ligne d'application d'échantillon varie de 0,1 à 5 μL, ce qui équivaut à une quantité d'échantillon de 5 à 1 000 μg. Par exemple, dans l'analyse de routine par électrophorèse des protéines sériques, le volume d'échantillon ajouté sur chaque centimètre de la ligne d'application ne dépasse généralement pas 1 μL, ce qui équivaut à 60 à 80 μg de protéine. Cependant, lors de l’analyse de lipoprotéines ou de glycoprotéines à l’aide de la même méthode d’électrophorèse, le volume de l’échantillon doit être augmenté en conséquence.
En conclusion, le volume d’échantillon le plus approprié doit être sélectionné en fonction de conditions spécifiques grâce à une série d’expériences préliminaires.
Sélection de la solution de coloration
Les bandes séparées dans l’électrophorèse sur membrane d’acétate de cellulose sont généralement colorées avant la détection. Différents composants de l'échantillon nécessitent différentes méthodes de coloration, et les méthodes de coloration adaptées à l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose peuvent ne pas être entièrement applicables au papier filtre.
Il existe trois grands principes pour choisir une solution de coloration pourmembrane en acétate de cellulose. Premièrement,Les colorants solubles dans l'eau doivent être préférés aux colorants solubles dans l'alcool pour éviter le rétrécissement et la déformation de la membrane provoqués par la solution de coloration de cette dernière. Après coloration, il est important de rincer la membrane à l’eau et de minimiser la durée de coloration. Sinon, la membrane pourrait s’enrouler ou se rétrécir, ce qui affecterait la détection ultérieure.
Deuxièmement, il est préférable de sélectionner des colorants ayant une forte affinité de coloration pour l’échantillon. Dans l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose des protéines sériques, l'amino noir 10B est couramment utilisé en raison de sa forte affinité de coloration pour divers composants des protéines sériques et de sa stabilité.
Troisièmement, des colorants de qualité fiable doivent être choisis. Certains colorants, bien qu'ils portent le même nom, peuvent contenir des impuretés qui donnent un fond particulièrement sombre après coloration. Cela peut même rendre floues les bandes initialement bien séparées, les rendant difficiles à distinguer.
Enfin, le choix de la concentration de la solution de coloration est important. Théoriquement, il pourrait sembler qu’une concentration plus élevée de solution de coloration conduirait à une coloration plus approfondie des composants de l’échantillon et à de meilleurs résultats de coloration. Cependant, ce n’est pas le cas. L'affinité de liaison entre les composants de l'échantillon et le colorant a une certaine limite, qui n'augmente pas avec l'augmentation de la concentration de la solution de coloration. Au contraire, une concentration trop élevée de la solution de coloration non seulement gaspille le colorant, mais rend également difficile l'obtention d'un fond clair. De plus, lorsque l'intensité de la couleur atteint une certaine valeur maximale, la courbe d'absorbance du colorant ne suit pas une relation linéaire, notamment dans les mesures quantitatives. Dans l'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose, la concentration de la solution de coloration est généralement inférieure à celle utilisée dans l'électrophorèse sur papier.
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Référence:Électrophorèse (deuxième édition) par M. Li
Heure de publication : 06 juin 2023