Préparation d'un gel d'agarose pour l'électrophorèse

Préparation du gel d'agarose pour l'électrophorèse

Remarque : portez toujours des gants jetables !

Instructions étape par étape

Pesée de la poudre d'agarose :uUtilisez du papier à peser et une balance électronique pour mesurer 0,3 g de poudre d'agarose (basé sur un système de 30 ml).

Préparation du tampon TBST :préparer 30 ml de tampon TBST 1x dans un erlenmeyer de 100 ml.

Dissolution de la poudre d'agarose :pVersez la poudre d'agarose dans le tampon TBST et agitez bien.Mettez-les dedansau micro-ondes et chauffer (généralement pendant 50 secondes, recouvert de papier d'aluminium) jusqu'à dissolution complète.

Refroidissement et ajout de Nuclease :uMettez des gants pour sortir le mélange du micro-ondes et laissez-le refroidir légèrement dans l'eau froide jusqu'à ce qu'il soit tiède (environ 60°C). Ajouter 2 µl de nucléase (substitut Eb) tout en agitant pour bien mélanger.

Préparation du moule en gel :

• Cmaigre et séchez leplateau de gel et dispositif de coulée de gelde la cuve d'électrophorèse.
•  Pdentelle le gelplateaudans le réservoir intérieur et insérez le peigne dans une position fixe.
• Mélangez la solution de gel d'agarose refroidie à environ 65°C et versez-la délicatement sur leplateau de geldans ledispositif de coulée de gel, en l'étalant lentement jusqu'à ce qu'il forme une couche de gel uniforme sur la plaque de verre.
• Laissez-le reposer à température ambiante jusqu'à ce que le gel se solidifie complètement.
• Retirez délicatement le peigne verticalement et retirez le ruban adhésif.
• Placez le gelplateaudans la cuve d'électrophorèse.

Important : assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air au niveau des dents du peigne. La surface du liquide doit être lisse et sans ondulations.

Exécuter le gel

Chargement du gel

Une fois le gel solidifié, placez-le dans la cuve d'électrophorèse et versez le tampon d'électrophorèse jusqu'à ce que le gel soit immergé.

Préparation des échantillons

• Sortez le marqueur et le tampon de chargement du réfrigérateur.
• Ajouter 6 µl de tampon de chargement aux échantillons et bien mélanger.
• A l'aide d'une micropipette, charger lentement les échantillons dans les grands puits du gel (veiller à ne pas percer le gel et ne pas distribuer la totalité du volume pour éviter les bulles d'air).
• Chargez le marqueur dans l'un des petits puits (rappelez-vous sa position).

Démarrage de l'électrophorèse

• Couvrir le réservoir d'électrophorèse et démarrer l'électrophorèse immédiatement après avoir chargé le gel.
• Réglez la tension sur 60-100 V. Les échantillons migreront de l'électrode négative (noire) vers l'électrode positive (rouge).
• Une tension plus élevée raccourcit la plage de séparation efficace du gel d'agarose.
• Arrêtez l’électrophorèse lorsque le colorant bleu de bromophénol atteint environ 1 cm du bord inférieur de la plaque de gel.

Observer les résultats

Après avoir séparé les bandes, arrêtez l'électrophorèse, retirez le gel, détectez-le et photographiez-le directement.

Utilisez un système d’imagerie sur gel pour photographier et observer les bandes (vérifiez s’il y a des bandes pour le marqueur ou les échantillons).

Après avoir obtenu votre carte de bande de gel, trouvez le marqueur. En fonction du marqueur, vous pouvez déterminer les bandes cibles !

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