Préparation des échantillons etChargement
En raison de l’utilisation d’un système tampon continu sans gel d’empilement, dans la plupart des cas, les échantillons doivent avoir une concentration appropriée et un petit volume. Utilisez unpipetteajouter lentement l'échantillon, à raison de 5 à 10 μg par puits, pour éviter une diminution significative de la résolution. Quandchargement de l'échantillon, l'alimentation doit être coupée. L'échantillon doit contenir un colorant indicateur (0,025 % de bleu de bromophénol ou d'orange) et du saccharose (10 à 15 %) ou du glycérol (5 à 10 %) pour augmenter sa densité, concentrer l'échantillon et empêcher la diffusion. Cependant, le saccharose ou le glycérol peuvent parfois provoquer des bandes en forme de U dans les résultats de l'électrophorèse, ce qui peut être évité en utilisant 2,5 % de Ficoll (polyvinylpyrrolidone).
Électrophorèse
La tension pour l'électrophorèse est de 5 à 15 V/cm, généralement autour de 10 V/cm. Pour la séparation de grosses molécules, la tension doit être inférieure, ne dépassant généralement pas 5 V/cm.
Coloration
Le colorant fluorescent bromure d'éthidium (EB) est couramment utilisé pour la coloration afin d'observer les bandes d'ADN dans le gel d'agarose. EB peut s'insérer entre des paires de bases de molécules d'ADN, provoquant sa liaison avec l'ADN. L'absorption de la lumière ultraviolette de 260 nm par l'ADN est transférée à l'EB, et l'EB lié émet une fluorescence à 590 nm dans la région rouge-orange du spectre de la lumière visible. La coloration du gel dans une solution de MgSO4 à 1 mmol/L pendant 1 heure peut réduire la fluorescence de fond provoquée par l'EB non lié, facilitant ainsi la détection de petites quantités d'ADN.
Le colorant EB présente plusieurs avantages : il est facile à utiliser, ne casse pas les acides nucléiques, a une sensibilité élevée et peut colorer à la fois l’ADN et l’ARN. L’EB peut être ajouté à l’échantillon et suivi à tout moment grâce à l’absorption UV. Après coloration, EB peut être éliminé par extraction au n-butanol.
Cependant, le colorant EB est un puissant mutagène et des précautions, telles que le port de gants en polyéthylène, doivent être prises lors de la manipulation. L'acridine orange est également un colorant couramment utilisé car il permet de différencier les acides nucléiques simple brin et double brin (ADN, ARN). Il présente une fluorescence verte (530 nm) pour les acides nucléiques double brin et une fluorescence rouge (640 nm) pour les acides nucléiques simple brin. De plus, d’autres colorants tels que le bleu de méthylène, le vert de méthylène et la quinoléine B peuvent être utilisés pour la coloration.
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Heure de publication : 20 décembre 2023