1. Classement
L'électrophorèse sur gel est divisée en types verticaux (y compris les gels en colonne et les gels en plaque) et en types horizontaux (principalement les gels en plaque) (Figure 6-18). Généralement, la séparation verticale est légèrement supérieure à l'horizontale, mais la préparation horizontale du gel présente au moins quatre avantages : il y a un support sous l'ensemble du gel, permettant l'utilisation d'agarose à faible concentration ; il est possible de préparer des plaques de gel d'agarose de différentes spécifications ; la préparation du gel et le chargement des échantillons sont plus pratiques ; la chambre d'électrophorèse est facile à construire et rentable. Étant donné que l’électrophorèse horizontale est réalisée avec la plaque de gel d’agarose entièrement immergée à environ 1 mm sous la surface du tampon d’électrophorèse, elle est également appelée électrophorèse immergée.
Réservoir d'électrophorèse DYCP-31DN pour électrophorèse sur gel d'agarose
2. Système tampon
Dans la séparation des acides nucléiques, la plupart des systèmes adoptent des systèmes continus. Les tampons d'électrophorèse couramment utilisés comprennent le tampon TBE (0,08mol/L Tris·HCl, pH 8,5, 0,08mol/L d'acide borique, 0,0024mol/L EDTA) et le tampon THE (0,04mol/L Tris·HCl, pH 7,8, 0,02mol/L acétate de sodium, 0,0018mol/L EDTA). Ces tampons sont généralement préparés sous forme de solutions mères 10x et dilués à la concentration requise lors de leur utilisation. Les taux de migration de l'ADN linéaire et circulaire dans le gel d'agarose varient en fonction du tampon utilisé. Dans le tampon THE, le taux de migration de l’ADN linéaire est supérieur à celui de l’ADN circulaire, tandis que dans le tampon TBE, c’est l’inverse.
3.Préparation du gel d'agarose
(1) Préparation du gel d'agarose horizontal
(a) Préparez la concentration requise de gel d’agarose en utilisant un tampon d’électrophorèse 1x.
(b) Chauffer l’agarose jusqu’à dissolution complète soit dans un bain-marie bouillant, sur un agitateur magnétique ou au micro-ondes. Refroidir la solution d’agarose à 55°C et ajouter le colorant bromure d’éthidium (EB) jusqu’à une concentration finale de 0,5 μg/ml.
(c) Scellez les bords des plaques de verre ou d'acrylique avec une petite quantité de gel d'agarose, ajoutez un peigne et positionnez les dents du peigne à environ 0,5 à 1,0 mm au-dessus de la plaque.
(d) Versez continuellement la solution de gel d'agarose fondu dans le moule en verre ou en plaque acrylique (l'épaisseur dépend du volume de l'échantillon d'ADN), en évitant l'introduction de bulles d'air. Laissez-le se solidifier naturellement à température ambiante.
(e) Retirez délicatement le peigne après solidification complète. Ajouter une quantité appropriée de tampon d’électrophorèse dans le réservoir de gel, en veillant à ce que la plaque de gel soit immergée à environ 1 mm sous la surface du tampon d’électrophorèse.
(2) Préparation du gel d'agarose vertical
(a) Enlever la graisse ou les résidus des plaques de verre en les lavant à l'éthanol.
(b) Placez les plaques d'espacement entre les barrages avant et arrière, alignez les bords des plaques d'espacement avec les barrages avant et arrière et fixez-les avec des pinces.
(c) Ajouter 2 % d’agarose dans un tampon 1x entre les bords des plaques d’espacement pour former un bouchon d’agarose de 1 cm de haut au fond de la chambre de coulée de gel.
(d) Versez le gel d'agarose fondu à la concentration souhaitée, préparé dans un tampon 1x, dans la chambre de gel jusqu'à 1 cm en dessous du sommet.
(e) Insérez le peigne en évitant de emprisonner des bulles d'air sous les dents du peigne. Parfois, des rides peuvent apparaître au niveau des dents du peigne pendant le refroidissement du gel d'agarose ; dans de tels cas, ajoutez simplement un peu d'agarose fondu sur le dessus pour le solidifier.
(f) Retirez le peigne. Pour éviter les fuites de tampon dans la fente de chargement, scellez la connexion entre la plaque de gel d’agarose et la chambre d’électrophorèse avec 2 % d’agarose et ajoutez la quantité requise de tampon.
(g) Ajouter 1x tampon d’électrophorèse à la chambre de gel.
(h) Chargez soigneusement les échantillons d’ADN sur le gel d’agarose sous le tampon.
Plus d'informations sur les connaissances de base sur l'électrophorèse sur gel d'agarose, nous les partagerons la semaine prochaine. J'aimerais que ces informations soient utiles à votre expérience.
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Heure de publication : 07 décembre 2023